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志贺氏菌属及检验方法

  志贺氏菌属(Shigella) 的细菌(通称痢疾杆菌),是细菌性痢疾的病原菌。临床上能引起痢疾症状的病原生物很多,有志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆菌等,还有阿米巴原虫、鞭毛虫、以及病毒等均可引起人类痢疾,其中以志贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。人类对痢疾杆菌有很高的易感性。在幼儿可引起急性中毒性菌痢,死亡率甚高。

一、生物学性状

  志贺氏菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别,为革兰氏阴性杆菌,长约2-3μ m ,宽0.5-0.7μ m 。不形成芽胞,无荚膜,无鞭毛,有菌毛。DNA的G+C为49-53克分子%(Tm法)。

  需氧或兼性厌氧。营养要求不高,能在普通培养基上生长,最适温度为37℃,最适pH为6.4-7.8。37℃培养18-24小时后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、边缘整齐,直径约2nm,宋内氏菌菌落一般较大,较不透明,并常出现扁平的粗糙型菌落。在液体培养基中呈均匀浑浊生长,无菌膜形成。

  本菌属都能分解葡萄糖,产酸不产气。大多不发酵乳糖,仅宋内氏菌迟缓发酵乳糖。靛基质产生不定,甲基红阳性,VP试验阴性,不分解尿素,不产生H2S。根据生化反应可进行初步分类。

  志贺氏菌属的细菌对甘露醇分解能力不同,可分为二大组。

  A、不分解甘露醇组:主要为志贺氏菌。又根据能否产生靛基质,进一步分靛基质阳性(1、3、4、5、6、9、10型)和靛基质阴性(2、7、8型)的志贺氏痢疾菌。

  B、分解甘露醇组:包括福氏、鲍氏、宋内氏菌。再按乳糖分解情况,分为迟缓分解乳糖的宋内氏和不分解乳糖的福氏和鲍氏菌。后者进一步再根据靛基质产生与否,分靛基质阳性(福氏菌1、2、3、4、5型和鲍氏菌5、7、9、11、13、15型)和靛基质阴性(福氏菌6型和鲍氏菌1、2、3、4、6、8、10、12、14)二类  抗原构造与分型:志贺氏菌属细菌的抗原结构由菌体抗原(O)及表面抗原(K)组成。主要抗原有三种。

  型特异性抗原:型多糖抗原为菌体抗原的一种,是光滑型菌株所含有的重要抗原。当菌株变为粗糙型时,此抗原也常随之消失,各菌型所含的型抗原不同,可用于区别菌种的型别。

  群特异性抗原:为光滑型菌株的次要抗原,也是菌体抗原的一种。特异性较低,常在数种近似的菌内出现。在福氏菌株中,由于所含群抗原不同,可将某些菌型分为多种亚型,如福氏菌2型,根据群抗原不同,可分成2a、2b两个亚型。

  表面抗原(K抗原):在新分离的某些菌株菌体表面含有此种抗原。不耐热,加热100℃1小时即被破坏。具有此种抗原的菌株,可阻止菌体抗原与相应免疫血清发生凝集。

  根据抗原构造的不同,按最新国际分类法,将本属细菌分为四个群、39个血清型(包括亚型)(见表二)

表二 志贺氏菌属抗原的分类

 

菌 名

血 清 分 类

生 化 特 性

亚 型

甘露醇

鸟氨酸脱羧酶

志贺氏菌

A

1~10

 

+

-

福 氏 菌

B

1~6

x、y变种

1a、1b、2a、2b、3a、3b

3c、4a、4b

+

-

鲍 氏 菌

C

1~15

 

+

-

宋内氏菌

D

1

 

+

-

 

 

  A群:也称志贺氏菌群,有10个血清型。不发酵甘露醇,无鸟氨酸脱羧酶,与其他各群细菌无血清学联系。

  B群:也称福氏菌群,已有13个血清型(包括亚型和变种)。最近又发现3个亚型(1c、4c、5b)。发酵甘露醇,无鸟氨酸脱羧酶。抗原结构较复杂,各型间有交叉凝集。每一福氏菌型具有二种抗原,即型特异性抗原和群抗原,前者只存在于同型菌株中,后者有许多种,存在于福氏各菌型中。例如福氏1b型除含有1型特异性抗原外,尚含有4、6群抗原。

  C群:也称鲍氏菌群,有15个血清型,分解甘露醇,无鸟氨酸脱羧酶。各型内无交叉凝集。

  D群:也称宋内氏菌群,仅有一个血清型。分解甘露醇,有鸟氨酸脱羧酶,迟缓发酵乳糖。有Ⅰ、Ⅱ相之分。

  抵抗力:志贺氏菌属在外界环境中的生存力,以宋内氏最强,福氏菌次之,志贺氏菌最弱。一般在潮湿土壤中能存活34天,37℃水中存活20天,在冰块中可存活96天,在粪便内(室温)存活11天。日光直接照射30分钟,56-60℃10分即被杀死,对高温和化学消毒剂很敏感,1%石炭酸中15-30分钟即被杀死,对氯霉素、磺胺类、链霉素敏感,但易产生耐药性。

  变异性:

  S-R型变异:菌落可由光滑型变为粗糙型,同时常伴有生化反应、抗原构造和致病性的变异。在机体内,尤其在慢性患者和恢复期患者,志贺氏菌可发生变异而失去原来的生化和抗原特性,成为不典型菌株。但其中部分不典型菌株,可通过10%胆汁肉汤等返祖为典型菌株。故在慢性患者或带菌者粪便检查时,对这类菌株要特别注意,必须多次反复检查。因这对传染源的发现及控制有重要意义。

  耐药性变异:自从广泛使用抗菌素以来,志贺氏菌的耐药菌株不断增加,给防治工作带来许多困难。国内部分地区报道(1972-1974),志贺氏菌对四环素的耐药率达74%、氯霉素73.6-97%、链霉素84-98%、合霉素75-100%、磺胺类97-100%,可见国内对常用几种抗菌素的耐药率相当高。

  毒力变异与其他变异:1963年南斯拉夫Mel氏首先创用依赖链霉素的志贺氏菌株(依链Sd株,口服预防痢疾。Sd株是一株必须有链霉素存在下才能生长的菌株,其毒力减弱但仍保持免疫原性。美国以天然变异无毒株与大肠杆菌杂交而获得的MH株制成疫苗,其免疫效果和稳定性均较Sd株差。我国正大力利用变异方法通过动物和药物处理等寻找安全有效可供口服的痢疾杆菌活菌苗,并已取得初步成效。

  与E.coli的鉴别:志贺氏菌与E.coli的区别,的确是很困难的,这也反映了这二者在DNA_DNA杂交显示密切相关性,实质是“同一种”。A.培养物常常是不运动的,赖氨酸是阴性。B.除了福氏志贺氏6、鲍氏志贺氏13和14、痢疾志贺氏3少数菌株外,在糖发酵时不产气。C.发酵粘液酸或乙酸盐洋菜上或Chiristensen柠檬酸洋菜 。如呈碱反应的菌株则类似与E.coli。D.鲍氏志贺氏菌和痢疾志贺氏菌在美国很少见。

二、流行病学 :

  人和灵长类是志贺氏菌的适宜宿主,营养不良的幼儿、老人及免疫缺陷者更为易感。据报道,每年约有14000例志贺氏菌病,但估计发病人数为30万。

  据FDA统计,1997年美国加州等5个州食源性疾病共为8051例,其中志贺氏菌引起的为1263例。

  志贺氏菌病常为食物爆发型或经水传播。和志贺氏菌病相关的食品包括色拉(土豆、金枪鱼、虾、通心粉、鸡),生的蔬菜,奶和奶制品,禽,水果,面包制品,汉堡包,和有鳍鱼类。志贺氏菌在拥挤和不卫生条件下能迅速传播,经常发现于人员大量集中的地方如餐厅、食堂。食源性志贺氏菌流行的最主要原因是从事食品加工行业人员患菌痢或带菌者污染食品,食品接触人员个人卫生差,存放已污染的食品温度不适当等。

三、致病性:

  志贺氏菌引起的细菌性痢疾,主要通过消化道途径传播。根据宿主的健康状况和年龄,只需少量病菌(至少为10个细胞)进入,就有可能致病。

  致病因素:志贺氏菌的致病作用,主要是侵袭力、菌体内毒素个别菌株能产生外毒素。

  侵袭力:志贺氏菌进入大肠后,由于菌毛的作用粘附于大肠粘膜的上皮细胞上,继而进入上皮细胞并在内繁殖,扩散至邻近细胞及上皮下层。由于毒素的作用,上皮细胞死亡,粘膜下发炎,并有毛细吸管血栓形成以至坏死、脱落,形成溃疡。志贺氏菌一般不侵犯其他组织,偶尔可引起败血症。目前认为不论是产生外毒素的还是只有内毒素的志贺氏菌,必须侵入肠壁才能致病。因此,对粘膜组织的侵袭力是决定致病力的主要因素。

  内毒素:志贺氏菌属中各菌株都有强烈的内毒素,作用于肠壁,使通透性增高,从而促进毒素的吸收。继而作用于中枢神经系统及心血管系统,引起临床上一系列毒血症症状,如发热、神志障碍,甚至中毒性休克。毒素破坏粘膜,形成炎症、溃疡,呈现典型的痢疾脓血便。毒素作用于肠壁植物神经,使肠道功能紊乱,肠蠕动共济失调和痉挛,尤其直肠括约肌最明显,因而发生腹痛、里急后重等症状。

  外毒素:志贺氏菌1型及部分2型(斯密兹痢疾杆菌)菌株能产生强烈的外毒素。为蛋白质,不耐热,75-80℃1小时即可破坏。其作用是使肠粘膜通透性增加,并导致血管内皮细胞损害。外毒素经甲醛或紫外线处理可脱毒成类毒素,能刺激机体产生相应的抗毒素。一般认为具有外毒素的志贺氏菌引起的痢疾比较严重。

  所致疾病:志贺氏菌引起的细菌性痢疾可分为两类6型。

  A、急性细菌性痢疾:又分急性典型、急性非典型、急性中毒性菌痢三型。急性典型菌痢症状典型,有腹痛腹泻、脓血粘便、里急后重、发热等症状。各型菌都可引起,以志贺氏菌引起的较重,宋内氏菌引起的较轻。经治疗,预后良好。如治疗不彻底,可转为慢性。急性非典型菌痢症状不典型,易诊断错误延误治疗,常导致带菌或慢性发展。急性中毒性菌痢小儿多见,各型菌都可发生。中毒性菌痢一系列的病理生理变化,主要是内毒素造成机体微循环障碍的结果。导致内脏淤血、周围循环衰竭(休克),主要功能器官灌注不足,发生心力衰竭、脑水肿,急性肾功能衰竭。严重微循环障碍,再加上内毒素损伤血管内皮细胞、激活凝血因子等,而发生弥漫性血管内凝血(DIC)。

  B、慢性细菌性痢疾:又分慢性迁延型、慢性隐伏型、急性发作型三型。慢性迁延型,通常由急性菌痢治疗不彻底等引起。病程超过2个月,时愈时发,大便培养阳性率低。在有临床症状时为急性发作型,该型往往在半年内有急性菌痢病史。慢性隐伏型菌痢,是在一年内有过菌痢病史,临床症状早已消失,但直肠镜可发现病变或大便培养阳性。

  志贺氏菌带菌者有三种类型。A.健康带菌者,是指临床上无肠道症状而又能排出痢疾杆菌者。这种带菌者是主要传染源,特别是饮食业、炊事员、和保育员中的带菌者,潜在的危险性更大。B.恢复期带菌者,是指临床症状已治愈的病人,仍继续排菌达2周之久者。C.慢性带菌者,是指临床症状已治愈,但长期排菌者。

  免疫性:病后有一定的免疫力,但免疫期短,也不稳定。可能因本菌属菌型众多,相互间无交叉免疫性之故。免疫性与血中抗体似乎无关,而与肠道粘膜细胞吞噬能力加强和机体对痢疾杆菌内毒素耐受性提高有关。肠道分泌型抗体即粪抗体亦有一定作用。粪抗体出现早、消失快,在脓血粘便中,粪抗体检出率高达90%。这为志贺氏疫苗经口免疫的可能性,提供了理论依据。

四、检验和控制:

(1-3见附录)

  4.增菌培养:

  宋内氏志贺氏菌的增菌培养;以无菌的手续称取样品25g放入事先加有0.5μg/mL新生霉素的250mL志贺氏菌肉汤中,将此混悬液于室温中静置10min并时时振摇之。将浸液倾入灭菌的500mL锥形瓶中,调整pH,必要时用1N NaOH或1NHCL调至pH7.2±0.2,再将此锥形瓶置于加有新鲜催化剂的厌氧缸中,放入GasPak并加水使之活化。因此厌氧罐内部温度较高,每次用后皆应将催化剂加热。将厌氧罐置于44.0℃水浴中培养20h,振摇混悬液后划线接种于麦康凯氏琼脂平板。于35℃培养20h。

  对其他志贺氏菌的增菌培养亦按上述方法进行。但加入新生霉素量为3μg/mL,并在厌氧环境下置42.0℃水浴培养。

  5.志贺氏菌的分离

  a.常规培养方法

  检查麦康凯琼脂平板,志贺氏菌的菌落为浅粉红色,半透明,将此可疑菌落接种于下列培养基中:葡萄糖肉汤,TSI琼脂斜面,赖氨酸脱羧酶肉汤,动力试验琼脂和胰胨。置35℃培养48h,但应在20h进行检查,弃去所有有动力、产H2S、产气、赖氨酸脱羧以及发酵蔗糖与乳糖的培养物。关于产生吲哚者,应弃去其44℃增菌物中的阳性培养物。至于42℃增菌培养中的所有可疑培养物皆有可能是阳性或是阴性,因此皆应予保留。

  b.生理学性状

  将初筛反应良好的培养物再接种其他生化试验,志贺氏菌的特性概述如下分离:H2S、尿素酶、葡萄糖、(产气)运动、赖氨酸、脱羧酶、蔗糖、侧金盏花醇、乳糖(2日)、KCN、丙二酸盐、柠檬酸盐、与水杨素皆为阴性;甲基红为阳性。用抗血清鉴定其血清型或参照表二所列32个血清型的生物学特性进行试验。其粘液酸盐(mucate)和乙酸盐(acetate)的反应是会有所帮助的。在这些反应中志贺氏菌一般为阴性,而不产气的大肠杆菌一般至少在此反应中的一项为阳性。

  c.血清学性状:

  将犊牛肉浸汁琼脂斜面的24h培养物混悬于3mL0.85%生理盐水中,使其浓度相当于 标准比浊管第5号,在洁净的玻璃平皿上用蜡笔标记9个3x1cm的方块.按照以下方案滴加混悬液,抗血清与生理盐水。 

  用接种针搅匀每个方块中的内容物,注意不要使方块之间互相混乱。动摇平皿3-4min以促进其凝集作用。并按以下记取其凝集反应的程度:0=无凝集反应,1+=勉强可察觉的凝集反应,2+=呈50%清澈的凝集反应,3+=呈75%清澈的凝集反应,4+=有可见的絮片状的凝集反应,混悬液完全清楚清澈透明。再以呈现明显阳性(2+、3+、4+)的多价血清所属的单价血清重新检查其混悬液,如呈阴性反应,则将混悬液置蒸锅中加热30min以水解能起干扰作用的荚膜抗原。此时如与反应单价血清呈阳性,则再以多价血清检查。由于这些系推测的血清型,故所有可能与所用血清呈阴性反应。

  预防控制志贺氏菌流行最好的措施是良好个人卫生和健康教育,水源和污水的卫生处理能防止水源性志贺氏菌的爆发。

  对可疑的食品,包括在食用前用手处理过或经轻微加热的食品、动物源性食品或消费者直接入口的产品,且其酸度范围在pH5.5-6.5之间。一般来说,当食品中含有大肠菌群、大肠杆菌和沙门氏菌时,含有志贺氏菌的可能性极大。

  菌痢的防治除对急性菌痢、慢性菌痢和各种带菌者进行“三早”措施(早期诊断、早期隔离和早期治疗)以消灭传染源外,应采取以切断传染途径为主的综合性措施。开展爱国卫生运动,抓好食品加工饮食服务行业的管理,对从事食品加工人员应定期作带菌者检查。